土壤中有益放线菌的高效分离、筛选和生物测定技术

摘　要：结合他人经验和近年作者的实际工作，本文系统介绍了土壤标本的采集、处理，放线菌的分离、纯化。放线菌分离物及其代谢产物对病原菌(真菌、细菌)、害虫和杂草的生物测定、评价，为研发微生物农药打下基础。

关键词：土壤标本；放线菌；分离；生物测定

中图分类号：Q 939．132

放线菌是产生抗生素活性物质最大的、具有很大经济价值的一类原核微生物。迄今，在工业、医学和农业上都有许多利用抗生素的成功实例。我国自20世纪50年代就开始研究利用抗生素，在农业上主要是防治各种作物的病虫害，如5406防治土传病害，推广面积曾达667万hm²以上；井冈霉素防治水稻、麦类纹枯病、菌核病等，每年应用面积1 333万hm²以上，自投放市场以来已30多年，一直对纹枯病高效，未发现抗药性。阿维菌素自20世纪90年代投放国内市场以来，已逐步成为继Bt制剂、井冈霉素之后生物农药产业的支柱产品，为我国生物农药市场赢得了巨大商机。国内至今已完成登记阿维菌素产品80多个，是明确最具发展潜力的生物农药之一。放线菌及其产生的抗生素的研究、开发与应用取得了巨大的社会、经济和生态效益。

放线菌大量存在于土壤中，从土壤中分离、纯化、快速筛选目标放线菌是抗生素开发、应用的基础。下面结合他人经验和作者近年的实际工作，从土壤采集、处理、菌株分离、纯化，放线菌及其代谢产物对病原菌、害虫、杂草等的生物测定等方面作一介绍。

1　放线菌的分离

1．1 土壤标本的采集

放线菌属好气性微生物，主要生活在较干燥、透气性好、中性到微碱性、有机质丰富的土壤中，特别是在我国南方热带及亚热带地区肥沃的土壤中，防线菌种类丰富。采集土壤标样时，应根据放线菌的生活特性，有针对性地进行采样。宜选择菜地、茶园、果园等地采样。选定采样地点后，先铲去表层土，挖取5～30 cm深的土壤数十克，装入牛皮纸信封，封好袋口；潮湿的土壤宜装入塑料袋或铝盒内，做好编号记录，带回实验室供分离用。

采回的土壤标本一般宜及时进行分离，如不能做到随采随分，宜将土壤放在阴凉、通风干燥处，使其风干，保藏备用，但保藏时间不宜过长。

放线菌的分离方法很多，这里主要介绍分离普通放线菌的弹土法和稀释画线法。

1．2　放线菌的弹土分离法

1．2．1 分离培养基

分离放线菌常用的培养基主要有：

a．高氏1号培养基：可溶性淀粉2.0％、K₂HPO₄0.05％、NaCl 0.05％、KNO₃ 0.1％、MgSO₄·7HO₂0.05％、FeSO₄ 0.001％、琼脂1.5％～2.0％、pH 7.2～7.4、在121℃(15磅)高温高压灭菌20 min。

b．葡萄糖——天门冬素琼脂培养基：葡萄糖1.0％、天门冬素0.05％、牛肉膏0.2％、K₂HPP₄ 0.05％、琼脂2.0％、pH6.8或自然、8磅灭菌30 min。

c．精氨酸一甘油琼脂培养基：精氨酸0.1％、甘油1.25％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂0 0.05％、NaCl0.1％、ZnSO₄·7H₂O0.000 1％、CuSO₄·5H₂O0.000 1％、Fe₂(SO₄)₃·6H₂O0.001％、MnSO₄·H₂O0.000 1％、琼脂2.0％，pH 9.0，8磅灭菌30 min。

1．2．2 平板培养基制备

根据分离量多少，准备好消毒高氏一号培养基500 mL或1 000 mL，灭菌的7 cm或9 cm直径培养皿中倒入10～20 mL培养基，制成平板备用。

1．2．3 土壤准备与接种

将土壤用研钵研细，60目过筛，取一定量细土平铺于灭过菌的光滑硬纸板上，纸面积略大于培养皿的口径，将多余的土轻轻倾去，见纸板上有一层细土粒粘附着则较为理想。接种时将倒好培养基的皿盖微微揭开，将土壤纸板粘土面向下轻轻插入覆盖其上，用皿盖微微触动一下纸板并立刻抽出，盖好皿盖即接种完毕。取下的土壤纸板，还可用于第2、第3及第4套分离培养皿接种。用于第2套接种时，轻轻弹动一下纸板；用于第3、第4套皿接种时，可在纸板背面稍加重弹力，使粘附于纸板上残留的少量土粒落下，达到控制理想的出菌率。

如果要分离罕见的放线菌，如小单孢菌、小双孢菌．游动放线菌或嗜热放线菌等，则可将土壤研细后作干热处理(120℃下处理1 h)。这样在分离时可以大大降低细菌、霉菌和链霉菌的数量，使罕见的放线菌出现的比率提高。

1．3　稀释分离法

此法的准备工作与弹土法相同，但稀释比应根据土壤中放线菌数量的多寡来决定。因此，往往在正式分离前需做一次预备分离试验，找出适当的稀释比。通过预备分离试验，可以观察到不同的土壤中放线菌、细菌和霉菌的数量关系，启示在分离工作中应采取何种对策。若土壤中细菌和霉菌过多时，可考虑在分离培养基中加入相应的抑菌剂。如抑制霉菌可加制霉菌素(50单位／mL)或多菌灵(30单位／mL)抑制细菌可加链霉素(25～50单位／mL)等。

称取研细的土壤5 g，加入盛有45 mL灭菌水的三角瓶中，充分振荡，制成10^-1土壤浓度悬浮液。待土粒沉淀后，吸取1.0 mL上清液，移入盛有9 mL灭菌水的试管中，制成10^-2土壤浓度悬浮液。依此类推，制成10^-3、10^-4和10^-5土壤浓度悬浮液，从土壤中分离放线菌多采用10^-3～10^-5土壤浓度。通常吸取上述3种浓度悬浮液0.1 mL(约2滴)，加到分离培养基平板上，用灭菌涂布棒涂均。

1．4　放线菌培养、挑菌和纯化

将上述接种好的培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。若分离嗜热放线菌，则应放在45～50℃下培养。3～4 d后即可长出放线菌单菌落。

在分离放线菌之前，必须学习、了解放线菌的形态特征、颜色等。初次分离，如果没有固定目标菌类，应将所有的放线菌单菌落都及时转接到高氏一号琼脂或葡萄糖一天门冬素琼脂斜面上，进行纯化

培养。一般链霉菌的菌落大，气生菌丝丰茂，色泽多种多样；而小单孢菌、诺卡氏菌、游动放线菌等菌落小，光秃无气生菌丝，色泽鲜艳。应注意选留后几类放线菌，在教学上可丰富分类学实验内容，同时也可为筛选新抗生素或酶制剂等提供菌源。

如果细菌、霉菌干扰不严重时，可延长分离平板的培养时间，让一些生长速度慢的放线菌陆续地生长出来，分批挑菌。一般纯化培养7～14 d，待生长成熟后终止培养，编号登记，备用。

2　放线菌的生物测定

经纯化培养的放线菌有否生产实用价值，即其代谢产物是否对有害生物(在农业上主要指病虫草)有毒性，需要通过生物测定来确定。放线菌的生物测定，不同的对象测定方法不同，一般是用放线菌的发酵代谢产物进行测定。下面将从放线菌发酵培养、代谢产物的提取、对病原菌、害虫和杂草的生物测定等方面作一介绍。

2．1 放线菌的发酵培养基

(1)日本培养基：2.5％葡萄糖、1.0％大豆粉、0.4％KC1、0.25％酵母提取汁、0.1％牛肉膏、0.5％(NH₄)₂SO₄、0.02％K₂HPO₄、0.3％CaCO₃(消毒前pH调至7.2)。(2)中国农大培养基：2％淀粉、0.1％KNO₃、0.066％K₂HPO₄·7H₂O、0.05％Mg-SO₄·7H₂O、0.05％NaCl、0.001％FeSO₄、pH7.2。

2．2　发酵培养及离心上清液的提取

250 mL三角瓶中每瓶装100 mL发酵培养基，高温高压消毒20 min，冷却备用。每瓶中接入培养7 d的放线菌菌块(d=0.9 mm)2～4块。在28～30℃恒温摇床上以120～150 r／min振荡发酵培养7 d，发酵液在离心机上以1 500 r／min离心10 min，取上清液装入消毒瓶中，加少许防腐剂保存备测。沉淀物(菌丝团)装另一消毒瓶，加等体积分析纯丙酮浸提24 h，以同样方法离心，取上清液，备测。

2．3　放线菌发酵液对有害生物的生物测定

2．3．1 发酵液对病原菌的毒性测定

2．3．1．1 对真菌的生物测定

一般是将放线菌发酵上清液与被测菌的培养基混合，配成不同浓度的发酵液培养基，倒入直径9 cm消毒培养皿，制成平板，同时以空白发酵培养基离心上清液和无菌水代替发酵上清液，与被测菌培养基混合作为对照。将生长一致的7 d菌龄被测菌菌块(d=0.6～0.8 cm)接入平板中央；也可取0.1 mL放线菌发酵液培养基平板上，用消毒三角玻棒涂布均匀，直接将被测病原菌块接入平板中央，有菌一面朝下。接种后置恒温培养箱(温度视不同的菌而定，一般多为28℃)培养，每隔1天按十字交叉法测量菌落直径，并观察菌落颜色、生长情况，菌核有无生成等，直到对照菌落长满培养皿为止。

2．3．1．2 对细菌的生物测定

细菌与真菌有所不同，一般是将被测细菌与该菌的培养基混合，充分摇匀，制成含细菌培养基平板。用0.7 cm直径的打孔器将定性滤纸打孔，圆纸片消毒后备用。将放线菌发酵离心上清液配成不同浓度，同样以空白发酵培养基离心上清液和无菌水为对照。圆纸片蘸发酵离心上清液或对照液，纸片充分浸湿，放入时不滴液为宜，放人含细菌培养基平板中央。置恒温培养箱中培养，培养箱中宜保持较高的湿度(RH＞85％)，以免“药纸片”很快干燥，影响药效。每隔1天按十字交叉法测量1次抑菌直径，并观察抑菌圈的清晰度，一般至少测量5次。

最后通过计算真菌菌落大小和对细菌的抑菌圈大小来评价放线菌发酵代谢产物对病原菌的毒性。真菌菌落越小，细菌抑菌圈越大，说明放线菌发酵代谢产物毒性强，反之则相反。

一般的，由于对分离到的放线菌到底哪种类型菌对病原菌有效，哪种菌无效，心中无底，而且初分离到的菌种数量较多。为减少发酵、离心等的工作量和费用，对初次分离到的菌株最好采用对峙培养法进行初步测定。只有那些经初步测定，对病原菌具有较强抑制活性的菌株才进行发酵培养、离心提取上清液作测定。当然有些放线菌可能对峙培养效果好，而发酵培养产毒差，有些菌则相反，造成误选或淘汰一些有潜力的菌株。

2．3．2 发酵液对害虫毒性的测定

放线菌发酵液对害虫的毒性测定可分为触杀和胃毒作用进行。

2．3．2．1 胃毒作用测定

方法1：将发酵液配成不同浓度药液，将供试害虫喜食的寄主植物叶或茎在药液中浸30～60 s(视植物类型而定，表面蜡质多的植物浸的时间要长些)，使表面濡湿，悬挂晾干不滴液，置入大培养皿或大试管，放入供试虫，每皿5～10头(条)(视虫量和培养皿及试管大小而定)，盖上皿盖或一层纱市封口。每处理重复3次，每隔一定时间观察、描述试虫的活动、取食情况，记录死虫数。

方法2：对于蚕、菜青虫或小菜蛾等食叶昆虫的测定，可采用以下方法：将2片供试虫寄主植物叶片正面涂药，将涂药叶面相对叠合，并用大头针严密订紧，将叶边缘修剪整齐，以免虫子接触药液，使虫子只能通过取食才能接触药液，每隔一定时间观察、描述试虫的活动、取食情况，记录死虫数。

2．3．2．2 触杀作用测定

方法1：将供试虫不取食的作物叶片正面、或塑料片用不同浓度的发酵液涂布，待药液干后，将供试虫放在上面，让其爬行，但不取食，几分钟后移入寄主叶片上，让其取食，正常饲养，每隔一定时间观察、描述试虫的活动、取食情况，记录死虫数。

方法2：供试虫饲养在寄主植物上，用喉头喷雾器将不同浓度的发酵液直接喷雾在试虫体表，每隔一定时间观察、描述试虫的活动、取食情况，记录死虫数。上述试验均需设空白发酵培养基离心上清液和无菌水作对照，如能增设一个供试虫常用防治药剂作对照则更好。

2．3．3 发酵液对杂草毒性的测定

将待测杂草种子用温水预浸24～48 h(视不同杂草种而定)备用。将放线菌发酵离心上清液配成不同稀释浓度，设空白发酵培养基离心上清液和无菌水为对照。

2．3．3．1 测定发酵液对杂草种子发芽率的影响

挑10粒饱满一致、预浸过的杂草种子放入不同浓度发酵离心液中浸24 h，捞出后分别置于用相同发酵液浓度浸过的吸水纸或滤纸上，放人培养皿，盖上盖，在30～35℃下催芽，每隔1天记录种子的发芽情况，观察芽的生长状况，并作描述。观察3～4次(6～8 d)，每处理最少重复3次，最终统计发芽率。

2．3．3．2 测定发酵液对杂苹根、芽生长的影响

将预浸过的杂草种子在30～35℃下催芽至露白，挑10粒芽长及生长基本一致的种子放入不同浓度发酵离心液中，在30℃恒温下培养，分别在3 d和6 d天测量杂草根、芽长，同时观察根、芽生长情况，如生长是否健壮，有无须根，颜色是否正常，并作描述。

所获数据进行统计分析后，即可初步判断某一放线菌是否具有开发、应用价值，是否值得进一步研究。

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